Direito em Debate

Salmo Raskin
Médico Pediatra, Especialista em Genética Clínica
Membro Titular da Sociedade Brasileira de Genética Clínica
Diretor do Laboratório GENETIKA - Curitiba/PR
Vice-Presidente do Instituto Brasileiro de Direito de Família/PR

RESUMO

Até o advento do Teste em DNA, não era possível garantir se um indivíduo era ou não o filho biológico de determinado casal. Com o advento dos testes que analisam o DNA, este problema ficou definitivamente resolvido, já que agora é possível não só apenas excluir os indivíduos falsamente acusados, porém também obter probabilidades de inclusão extremamente próximas de 100%, ou seja, é possível através de Teste em DNA afirmar se um indivíduo é com certeza o genitor de determinada pessoa. A técnica de PCR (Reação em Cadeia pela Polimerase) vem sendo utilizada há mais de 5 anos nesta área com enorme sucesso e precisão. Neste artigo descrevemos por que a PCR deveria, ao nosso ver, ser amplamente aceita na realização dos Testes de Paternidade em DNA.

INTRODUÇÃO

POR QUE DNA?

Nos últimos dez anos os métodos tradicionais de Investigação de Paternidade (Marcadores Sangüíneos, Cromossômicos, Séricos, Enzimáticos e Leucocitários HLA) vem sendo substituídos, nos melhores Laboratórios de Determinação de Paternidade, pelas modernas técnicas de identificação deste vínculo em DNA. Diversos estudos demonstram que cerca de 1\4 dos Testes de Determinação de Paternidade tem como resultado a exclusão de um indivíduo acusado de ser o pai biológico. Fazendo-se uso de todos os marcadores tradicionais em conjunto, a probabilidade de exclusão de um homem falsamente acusado de paternidade atinge nos melhores laboratórios uma taxa de cerca de 95%, ou seja, em cada 100 testes realizados pelos métodos tradicionais que deveriam apontar uma exclusão, existe uma chance de que em 5 exames não se consiga provar que um indivíduo falsamente acusado não seja o pai biológico, com conseqüências óbvias. Estas falhas dos exames que utilizam os marcadores tradicionais, são devidas a presença muito freqüente de um mesmo marcador tradicional em diversas pessoas da população, ou seja, há uma variabilidade pequena entre os indivíduos em seus marcadores tradicionais. Por exemplo, se a mãe tem um tipo sangüíneo A e o filho também possui o tipo sangüíneo A, qualquer que seja o tipo sangüíneo do suposto pai (O, A, B, AB), não será possível excluir ,através da tipagem ABO, a possibilidade dele ser o pai biológico. Com o advento das técnicas de análise em DNA para Determinação de Paternidade, todas estas falhas foram resolvidas, já que a extrema variabilidade das seqüências genéticas que constituem o DNA, fazem com que a freqüência de cada marcador seja extremamente baixa na população, ou seja, uma característica (alelo) no DNA presente em um determinado indivíduo, muito dificilmente estará presente em outro indivíduo da população que não seja o seu pai e\ou sua mãe biológica. Além disto, o Teste em DNA é o único teste de Determinação de Paternidade capaz de confirmar o vínculo com certeza, ou seja, de afirmar que o suposto pai é o pai biológico e/ou que a mãe é realmente a mãe biológica. Em um teste em DNA feito com qualidade, todos aqueles indivíduos que não puderem ser excluídos, assumem automaticamente uma probabilidade de paternidade extremamente próxima de 100%. Pelos motivos técnicos acima citados, a American Association of Blood Banks (AABB), órgão máximo de supervisão, controle e regulamentação de laboratórios que realizam exames de determinação de Paternidade nos Estados Unidos admite que, baseado na extrema eficiência atingida atualmente pelos testes em DNA, não há mais necessidade de se realizar testes utilizando os marcadores tradicionais, a não ser em regiões onde as modernas técnicas em DNA não estejam disponíveis à população.

REALIZAR O TESTE EM SUAS PRÓPRIAS INSTALAÇÕES OU TERCEIRIZAR?

É importante que o laboratório que se propõe a oferecer o Teste de Paternidade em DNA, seja qual for a técnica escolhida, seja especializado e esteja preparado, não só em termos de equipamentos, mas principalmente com recursos humanos capacitados para efetuar todas as etapas da técnica escolhida, dentro de suas dependências (desde a coleta de material até a entrega do laudo), reduzindo muito a possibilidade de haver alguma quebra na cadeia de custódia do material, aumentando portanto a segurança e a privacidade do exame e do resultado. Caso um laboratório opte por terceirizar este teste, é importante que receba um treinamento especializado, pois a coleta e mesmo o envio deste exame segue normas muito diferentes de outros exames de Patologia Clínica. Terceirizar um exame de Determinação de Paternidade para um laboratório do exterior não é o mesmo que terceirizar um exame da rotina de patologia clínica para o exterior. Assim como os povos diferem-se entre si, também o DNA difere não só de indivíduo para indivíduo, mas também de população para população. Os resultados dos cálculos de probabilidade de paternidade gerados, tomando por base dados da população norte-americana, por exemplo, podem ser substancialmente diferentes dos resultados destes mesmos cálculos quando usados dados genéticos da população brasileira. Para que o exame de determinação de paternidade pelo DNA, confira resultados particularizados para as características étnicas peculiares da população brasileira, é imprescindível que se disponha de um estudo prévio das peculiaridades genéticas da nossa população. Este banco de dados não deve ser montado "na medida em que os casos vão aparecendo", sob pena de comprometer os resultados dos primeiros exames, e como conseqüência abalar a confiabilidade no laboratório. Outro pré-requisito para absoluta segurança dos resultados é que todas as etapas do exame sejam supervisionadas por um profissional qualificado.

MULTI-LOCUS, LOCUS ÚNICO OU PCR?

Muito se tem discutido no Brasil a respeito de qual técnica seria a melhor, se é que existe técnica melhor. Cada uma tem suas vantagens e desvantagens. No quadro 1 citamos os motivos e as vantagens pelas quais escolhemos e realizamos há mais de 4 anos nossos testes pela PCR analisando Short Tandem Repeats (STRs).

A PCR-STR É UM BOM MÉTODO PARA TESTES DE PATERNIDADE EM DNA?

No Brasil, e apenas neste país, a PCR tem sofrido críticas quando utilizada como método de escolha nos Testes de Determinação de Paternidade. Muitas das críticas citadas há anos atrás eram construtivas, e tiveram como conseqüência o aprimoramento do teste em DNA por PCR, a ponto de hoje ter sido atingido um padrão excelente. Ao contrário da controvérsia gerada no Brasil, nos Estados Unidos a PCR é amplamente aceita em Testes de Paternidade há muitos anos. O Laboratório que mais realiza testes de Paternidade em DNA no mundo todo, LabCorp, é um Laboratório norte-americano, que segue as rigorosas leis de controle de qualidade deste país, e realiza todas as suas análises pela técnica de PCR. Este Laboratório já realizou mais de 200.000 (duzentos mil casos) de paternidade usando apenas a PCR, e atualmente tem o incrível volume de 7.000 (sete mil) casos por mês utilizando apenas a PCR (1). Sem termos de comparação, nossa experiência no Brasil não é de toda desprezível; Nos últimos três anos realizamos a análise de 4.500 indivíduos envolvidos em Testes de Paternidade, utilizando apenas a técnica de PCR-STR, e temos hoje um volume de 70 casos/mês, que vem crescendo em média 10% a cada mês.

POR QUE E COMO DEFENDER O USO DA PCR-STR COMO MÉTODO PARA TESTES DE PATERNIDADE EM DNA?

No Brasil muitas críticas tem sido feitas a PCR, algumas oriundas de pessoas cientificamente respeitadas e outras de pessoas que repetem a opinião de pessoas cientificamente respeitadas, estas últimas, muitas vezes, sem compreender o conteúdo de suas própria palavras. Toda crítica merece o direito a defesa. Para aqueles que se interessarem em analisar as críticas e as defesas de maneira imparcial, seguem algumas críticas e nossos comentários.

Crítica - "A VARIABILIDADE DA MAIORIA DOS STRs TESTADOS POR PCR É TÃO LIMITADA QUE UM NÚMERO ENORME DE LOCOS PRECISARIAM SER ANALISADOS"

Comentário: O fato dos locos analisados por PCR terem variabilidade menor do que os comumente analisados por sonda multi ou unilocais, realmente exige que a maioria dos casos sejam analisados por um número maior de STRs. Porém isto de modo algum é contratempo, pelo contrário. Ninguém duvida que é tecnicamente mais fácil testar 12 STRs do que analisar duas sondas unilocais ou quatro multilocais. A abundância de STRs do genoma humano é uma fonte inesgotável de variabilidade, já que existem hoje centenas de STRs aptos a serem utilizados e automatizados em sistemas Multiplex. Por outro lado, a alta variabilidade das sondas unilocais e multilocais carregam ao mesmo tempo o fardo das altas taxas de mutação encontradas nestes locos, que tornam complicada a análise de muitos casos quando utilizamos sondas multilocais ou unilocais. Será uma mutação única ou será uma exclusão de paternidade? Esta dúvida, tão frequente nos laboratórios que optam pela utilização de sondas multilocais (e algumas unilocais como D1S7) não fazem parte da rotina dos Laboratórios que escolheram a PCR, devido as baixas taxas de mutação dos STRs (2).

Crítica - "MESMO QUE SEJAM ANALISADOS POR PCR VÁRIOS LOCOS DIFERENTES, NUNCA SÃO ALCANÇADAS AS PROBABILIDADES DE PATERNIDADE E PODER DE EXCLUSÃO DAS SONDAS MULTILOCAIS OU UNILOCAIS"

Comentário: As probabilidades de Paternidade dependem de cada caso. Se naquele caso específico os alelos paternos obrigatórios forem extremamente raros, pode-se atingir probabilidades de paternidade altíssimas usando um número muito pequeno de marcadores, sejam eles STRs ou provenientes de sondas unilocais ou multilocais. Em outro caso, se os alelos paternos obrigatórios forem extremamente frequentes na população, para se atingir as mesmas probabilidades de paternidade necessitaremos analisar um número maior de marcadores, sejam eles STRs ou sondas unilocais ou multilocais. É importante compreender que não é o número de marcadores que determina a qualidade final do exame (se assim fosse os próprios exames de PCR seriam superiores aos outros, pela abundancia de STRs potencialmente testáveis), mas sim o poder de exclusão do Sistema e a Probabilidade de Paternidade mínimas necessárias para assinar um laudo (3). Se para se atingir estes requisitos mínimos forem necessários, naquele caso específico, analisar 6 STRs, serão analisados 6 STRs; Se para se atingir estes requisitos mínimos forem necessários, naquele caso específico, analisar 22 STRs, serão analisados 22 STRs. Existem casos aonde 7 sondas unilocais não foram capazes de acusar uma exclusão, e o primeiro STR testado acusou a exclusão (4). No Brasil, foi descrito um caso semelhante, aonde uma sonda multilocal não foi capaz de excluir um caso facilmente excluído por vários STRs (5). Nossa opinião, é de que não existe o tão almejado "padrão ouro" e que todas as tres técnicas são extremamente eficientes quando bem utilizadas.

Crítica - "A ESTRUTURA DAS POPULAÇÕES HUMANAS FAZ COM QUE A CONFIABILIDADE DOS TESTES DE PCR SEJA PEQUENA"

Comentário: Diversos artigos científicos já comprovaram exaustivamente que a subestrutura populacional, mesmo que presente, tem efeito mínimo no índice de Paternidade final, e efeito negligível na conclusão final (exclusão ou inclusão).

Crítica - "A PCR DEVE TER UMA PAPEL EXCLUSIVAMENTE COMPLEMENTAR AS SONDAS MULTILOCAIS EM DETERMINAÇÃO DE PATERNIDADE"

Comentário: Nos Estados Unidos praticamente as sondas multilocais já não são mais utilizadas pelas altas taxas de mutação. Como a PCR poderia ser complementar a uma técnica que tem seus dias contados nos Laboratórios de Determinação de Paternidade?

Crítica - "SÓ DEVEMOS USAR PCR QUANDO AS AMOSTRAS SÃO PEQUENAS OU DEGRADADAS"

Comentário: Esta é uma das críticas mais interessantes devido a sua falta de embasamento científico; Obviamente qualquer técnica que é eficiente para analisar pouca quantidade de DNA ou DNA degradado, serve também para quando o DNA estiver intacto ou em grande quantidade, como na maioria dos casos de Testes de Paternidade. O contrário sim seria verdadeiro, ou seja, em Testes de Paternidade nos quais contamos com pouco DNA ou degradado (exumação, recém-nascidos, exame pré-natal, área criminal) a PCR é a única técnica que deveria ser usada!

Crítica - "POR CAUSA DA POSSIBILIDADE DE MUTAÇÕES, EXCLUSÕES DE PATERNIDADE NUNCA PODEM SER BASEADAS EM UM ÚNICO SISTEMA, PORTANTO NÃO SE DEVE USAR SÓ PCR"

Comentário: Esta é uma regra da Associação Americana de Bancos de sangue que deve ser obedecida, apesar de que, devido a baixa taxa de mutações dos STRs, uma única exclusão já poderia ser considerada como falsa paternidade, o mesmo não valendo para sondas unilocais e muito menos para multilocais (2). Repare que a palavra "Sistema" tem sido utilizada de maneira dúbia, pois a AABB se refere a pelo menos dois LOCOS para conferir um laudo de exclusão, e análises em duplicata, porém jamais exigindo que um Laboratório realize o mesmo exame duas vezes utilizando Técnicas diferentes. O exemplo do LabCorp citado acima, é auto-explicativo novamente. O fato de que normalmente se analisam mais locos quando utiliza-se a técnica de PCR-STR, é um excelente controle de qualidade intra-analítico, ou seja, uma PCR controla a qualidade da outra, tornando extremamente improvável que se erre tecnicamente 2 vezes. Praticamente todos os Laboratórios que realizam exames de Paternidade em DNA tem sua técnica preferida, e realizam todas análises com a mesma técnica. Aliás, esta pratica é rotineira em Patologia Clínica.

Crítica - "O ÍNDICE DE PATERNIDADE DE 99,99%, OU SEJA, 9.999 ACERTOS EM 10.000 INCLUSÕES, OU 1 ERRO EM 10 MIL INCLUSÕES, É INACEITÁVEL DO PONTO DE VISTA ÉTICO, MÉDICO E CIENTÍFICO"

Comentário: Tudo depende dos interesses de quem dita o que é aceitável e o que é inaceitável. Nos EUA, um país que não tem por tradição poupar esforços na defesa do cidadão, as Probabilidades de Paternidade são caracterizadas da seguinte maneira; 90-94% - PATERNIDADE PROVÁVEL; 95-99% - PATERNIDADE MUITO PROVÁVEL; 99-99,73% - PATERNIDADE EXTREMAMENTE PROVÁVEL; e ACIMA DE 99,73% - PATERNIDADE PRATICAMENTE PROVADA (6). As baterias de STRs utilizadas nos primórdios do uso desta tecnologia atingiam probabilidades de 99,9%. Os críticos da PCR consideraram então estas probabilidades " inaceitáveis do ponto de vista ético, médico e científico". A pressão serviu como alavanca para que sistemas ainda mais robustos fossem criados. Atualmente, as Probabilidades de Paternidade média geradas pelos STRs são superiores a 99,99%. O Poder de discriminação de uma bateria de doze STRs (número médio de indivíduos que teriam que ser analisados pelo sistema para encontrar duas pessoas com os mesmos alelos nos 12 marcadores) é de cerca de um em 178 bilhões a um em 3 trilhões, ou seja, muitas vezes a população do planeta (3). Você considera este número aceitável para a qualidade do seu Laboratório?

Diante destas evidências, os críticos da PCR se encontram agora divididos; alguns decretaram que 99,99% é uma probabilidade " inaceitável do ponto de vista ético, médico e científico"; outros estão começando a substituir suas metodologias pela PCR-STR, porém, estes últimos terão de suportar o ônus enorme de ter criticado a técnica de maneira tão contundente no passado, a ponto de que dificilmente suas próprias críticas deixarão de ser usadas contra si próprios se agora optarem pela PCR.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS:

Raskin S. – Investigação de Paternidade – Manual Prático do DNA. Editora Juruá – 2000

Whittle M., Fontes de erro nos Testes de Paternidade. Newslab 16:106-108 (1996).

Inclusion Probabilities in Parentage Testing. AABB, capítulo 18, pág. 238 (1983).  

Endereço do autor: Dr. Salmo Raskin
Centro de Aconselhamento e Laboratório Genetika
Alameda Augusto Stellfeld, 1516 Curitiba Paraná 80730-150
Fone: (041) 2326838 Fax: (041) 2325206
Email: Este endereço de e-mail está protegido contra SpamBots. Você precisa ter o JavaScript habilitado para vê-lo.